小鼠甲狀腺過氧化物酶體(TPO-Ab)ELISA試劑盒檢測原理

Elisa試驗是一種敏感性高，特異，重復(fù)性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗的各領(lǐng)域中。依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物T顯色，T在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

小鼠甲狀腺過氧化物酶體(TPO-Ab)ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.     酶標(biāo)儀（450nm）

2.     高加樣器及頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

小鼠甲狀腺過氧化物酶體(TPO-Ab)ELISA試劑盒操作注意事項

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解后再使用。

2.  實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液即可視為陰性對照或者空白；預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。

4.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.  液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為：80、40、20、10、5、2.5 pg/ml

試劑的準(zhǔn)備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

小鼠甲狀腺過氧化物酶體(TPO-Ab)ELISA試劑盒操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.  待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.  隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

Elisa包被的條件

包被用原或體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH 等應(yīng)根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定。體和蛋白質(zhì)原一般采用 pH9.6 的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2 的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL 緩沖液作為稀釋液的。通常在 ELISA 板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2 小時被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-2 0ug/ml。

封閉

封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。原或體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA 其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。常用的封閉劑是0.05%-0.5%

的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其的特點是價廉，可以高濃度使用(5%)。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。封閉是否要，取決于 ELISA 的模式及具體的實驗條件。并非的ELISA 固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高。一般說來，雙體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高的，操作時洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。是用單腹水直接包被時，因其中大量非體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的(見2.2.2)。包被好的E LISA 板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。

結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的體(或原)，是 ELISA 中關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化，也保持了體(或原)的免疫。結(jié)合物中酶與體(或原)之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量有或少含有游離的(未結(jié)合的)酶或游離的體(或原)。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。

小鼠甲狀腺過氧化物酶體(TPO-Ab)ELISA試劑盒酶要求

用于ELISA的酶應(yīng)合以下要求：，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。

在 ELISA 中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA 試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。

國產(chǎn) ELISA 試劑一般HRP 制備結(jié)合物。HRP 是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶( 酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無色糖蛋白在275nm 波長處有吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm 波長處有吸收峰。HRP 的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù))表示，是403nm 的吸光度與280nm 吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥?.0。

HRP 除合上述的ELISA 中標(biāo)記酶的要求外，更有價格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點。值得注意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ 外，更應(yīng)注意酶的活力。高純度的酶如保存不當(dāng)，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進行試驗。

國外很多 ELISA 試劑采用堿性磷酸酶(AP)作為標(biāo)記酶。常用的AP 有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的 AP 分子量為80000，酶作用的適合pH 為8.0；用小牛腸膜中提取的AP 分子量為10 0000，適pH 為9.6。在ELISA 中，AP 系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP 系統(tǒng)，空白值也較低，但AP 價格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較 HRP 低。

原和體

制備結(jié)合物時所用體一般均為純度較高的 IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。用親和層析純的體，這樣酶結(jié)合物均具有特異的免疫，可以在高稀釋度進行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底淺淡。如用F(ab')2 進行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本中RF 的干擾。在ELISA 中用酶標(biāo)原的模式不多，總的要求是原須是高純度的。