小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒檢測(cè)原理

Elisa試驗(yàn)是一種敏感性高，特異，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物T顯色，T在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.     酶標(biāo)儀（450nm）

2.     高加樣器及頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒操作注意事項(xiàng)

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解后再使用。

2.  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液即可視為陰性對(duì)照或者空白；預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。

4.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為：80、40、20、10、5、2.5 pg/ml

試劑的準(zhǔn)備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.  待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.  隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

Elisa包被的條件

包被用原或體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH 等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定。體和蛋白質(zhì)原一般采用 pH9.6 的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2 的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL 緩沖液作為稀釋液的。通常在 ELISA 板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2 小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-2 0ug/ml。

封閉

封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。原或體包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA 其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。常用的封閉劑是0.05%-0.5%

的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用(5%)。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。封閉是否要，取決于 ELISA 的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非的ELISA 固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說來，雙體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。是用單腹水直接包被時(shí)，因其中大量非體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測(cè)定中，封閉一般是不可少的(見2.2.2)。包被好的E LISA 板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。

結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的體(或原)，是 ELISA 中關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化，也保持了體(或原)的免疫。結(jié)合物中酶與體(或原)之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量有或少含有游離的(未結(jié)合的)酶或游離的體(或原)。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。

小鼠雙鏈DNA體/天然DNA體(dsDNA)ELISA試劑盒結(jié)合物的制備

酶標(biāo)記體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。

( 1)戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記體。ELISA 中常用的酶一般此法交聯(lián)。它具有操作簡(jiǎn)便、(結(jié)合率達(dá)60%-70%)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，體與體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中， 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與體作用而形成酶標(biāo)體。也可先將體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1 的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的以敏感度，但其偶聯(lián)的率較一步法低。

( 2)過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí)，過碘酸鈉將HRP 分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成 Schiff 氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其比例為：酶/體=1-2/1 。此法簡(jiǎn)便，一般認(rèn)為是HRP 可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為試劑較為強(qiáng)烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。

按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響 ELISA 中后的酶測(cè)定，因經(jīng)過徹底洗滌，游離酶可被除去，并不影響終的顯色。但游離的體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和體后用于檢測(cè)，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。銨鹽析法為簡(jiǎn)便，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶，但相當(dāng)數(shù)量的游離體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶、游離體和純結(jié)合物而取得的分離效果，但費(fèi)用較貴。

結(jié)合物制得后，在用作 ELISA 試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過低，則又影響檢測(cè)的敏感性。所以須對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的靈敏度，合適

的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo)體本身而言，它的工作濃度是指與其相應(yīng)原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽(yáng)性反應(yīng)的稀釋度。例如某一 HRP：人IgG 制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000 稀釋后，在與人 IgG 包被的固相作ELISA試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測(cè)中，酶標(biāo)體的適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被原或體的純度以及整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時(shí)間等的影響，因此須在實(shí)際測(cè)定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能高敏感度的稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。